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实验技术交流

荧光定量pcr常见问题分析

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/6/26     浏览次数:    

本文主要对荧光定量pcr实验中常见问题进行分析,帮助大家理解这些问题产生的原因,从而消除疑问,得到更好的荧光定量pcr实结果。

1.无ct值出现

荧光定量pcr无ct值现象

答:

1.检测荧光信号的步骤有误: 一般sg 法采用72℃延伸时采集,taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号
2.引物或探针降解: 可通过page 电泳检测其完整性
3.模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起
4.模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况


2.ct值出现过晚(ct>38)

荧光定量pcr ct值出现过晚

答:

1.扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等
2.pcr各种反应成分的降解或加样量的不足

3.pcr产物太长: 一般采用80-150bp 的产物长度


3.标准曲线线性关系不佳

荧光定量pcr标准曲线线性关系不佳

答:

1.加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。

2.标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品

3.引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针
4.模板中存在抑制物,或模板浓度过高

4.负对照有信号

荧光定量pcr负对照有信号

答:

1.引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现

2.引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比

3.镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix 试剂盒

4.模板有基因组的污染:rna 提取过程中避免基因组dna 的引入,或通过引物设计避免非特异扩增


5.溶解曲线不止一个主峰
荧光定量pcr溶解曲线不止一个主峰

答:

1.引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现
2.引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比
3.镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix 试剂盒
4.模板有基因组的污染:rna 提取过程中避免基因组dna 的引入,或通过引物设计避免非特异扩增


6.扩增效率低
荧光定量pcr扩增效率低

答:

1.反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解
2.反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法
3.反应体系中有pcr 反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响


7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线,如何判断?

荧光定量pcr时,不同仪器同一试剂产生的不同曲线

答:

判断标准:扩增效率,灵敏度,特异性。如果扩增效率在90%-110%,都是特异性扩增,都可以把数据用于分析


8.扩增曲线的异常?比如“s”型曲线?

荧光定量pcr出现"s"曲线

答:

1.参比染料设定不正确(mastermix 不加参比染料时,选none)
2.模板的浓度太高或者降解
3.荧光染料的降解

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