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实验技术交流

细胞培养常见疑难问题解答

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/6/24     浏览次数:    

本文主要对细胞培养过程中,常见的一些疑难问题进行解答。不足之处,欢迎各位小伙伴联系探讨交流!

1.冷冻管应如何解冻?
  取出冷冻管后,须立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。


2.细胞冷冻管解冻培养时,是否应马上去除dmso?
  除少数特别注明对dmso敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除dmso即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。


3.可否使用与原先培养条件不同之培养基?
  不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基,若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活。


4.可否使用与原先培养条件不同之血清种类?
  不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。


5.何谓fbs, fcs, cs, hs ?
  fbs (fetal bovine serum)和fcs (fetal calf serum)是相同的意思,两者都是指胎牛血清,fcs乃错误的使用字眼,请不要再使用。cs (calf serum)则是指小牛血清。hs (horseserum)则是指马血清。


6.培养细胞时应使用5%或10% co2?或根本没有影响?
  一般培养基中大都使用hco3-/co32-/h+作为ph的缓冲系统,而培养基中nahco3的含量将决定细胞培养时应使用的co2浓度。当培养基中nahco3含量为每公升3.7 g时,细胞培养时应使用10% co2;当培养基中nahco3为每公升1.5g时,则应使用5% co2培养细胞。


7.何时须更换培养基?
  视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。


8.培养基中是否须添加抗生素?
   除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。


9.附着性细胞继代时所使用之trypsin-edta浓度?应如何处理?
  一般使用之trypsin-edta浓度为0.05% trypsin-0.53mmedta.4 na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20℃,避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低,并可减少污染之机会。


10.悬浮性细胞应如何继代处理?
  一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。


11.欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速?

  欲回收动物细胞,其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10分钟,过高之转速,将造成细胞死亡。


12.细胞之接种密度为何?
  依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。


13.细胞冷冻培养基之成份为何?
  动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10%dmso (dimethyl sulfoxide)和90-95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意:由于dmso稀释时会放出大量热能,故不可将dmso直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。


14. dmso之等级和无菌过滤之方式为何?
  冷冻保存使用之dmso等级,必须为tissue culture grade之dmso (如sigma d2650),其本身即为无菌状况,第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4°c,避免反复冷冻解冻造成dmso之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会。若要过滤dmso,则须使用耐dmso之nylon材质滤膜。


15.冷冻保存细胞之方法?
  冷冻保存方法一:冷冻管置于4℃30~60分钟→(-20℃30分钟*)→-80℃16~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。
  冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3℃至–80℃以下,再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。


16.细胞欲冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度?
  冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial为宜。


17.应如何避免细胞污染?
  细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。


18.如果细胞发生微生物污染时,应如何处理?

  加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。


19.支原体(mycoplasma)污染的细胞,是否能以肉眼观察出异状?
  不能。除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。


20.支原体污染会对细胞培养有何影响?
  支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。


21. co2培养箱之水盘如何保持清洁?
  定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。

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