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实验技术交流

数字PCR - 简介 - 应用 - 实验步骤

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/5/10     浏览次数:    

数字PCR是继常规PCR和定量PCR之后的第三代PCR技术,是一种基于泊松分布原理对核酸分子绝对定量的方法。

PCR发展历程,数字pcr为第三代PCR


数字PCR技术(微滴式)原理:将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴,其中每个微滴或不含待检核酸靶分子,或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后,逐个对每个微滴进行检测,有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度,在核酸分子的绝对计数/定量领域具有极大的应用潜力。


数字PCR(微滴式)的优点:
无需标准曲线;检测下限可低至单拷贝
不依赖Ct值,不依赖扩增效率,能克服PCR抑制剂的影响
灵敏度可达0.001%,适合检测复杂背景下的靶标序列
使用灵活,可按实验需要调整通量和灵敏度
高通量:一次运行可检测96个样本
高灵敏度:合并分析96 孔,一个样本多于140万微滴
检测成本低

数字PCR技术原理(微滴式)


数字PCR的应用:拷贝数变异、稀有突变检测、转基因成分检测、低丰度病原微生物检测、微小差异基因表达分析、NGS测序文库定量等

数字PCR的应用

数字PCR的应用


数字PCR实验步骤

1.制备含有核酸样品的ddPCR反应液
将引物、探针、DNA模板、ddPCR supermix配制成20ul反应液

制备ddpcr反应液


2.制备微滴
将20ul反应液,加入DG8微滴发生卡组相应的孔内,并将微滴反生卡放入微滴生成器,在2.5分钟内将每个20ul反应液分成20000个微滴

制备微滴


3.使用EvaGreen或水解探针进行PCR扩增

将微滴转移到96孔PCR板上,封膜并运行PCR程序进行扩增

使用EvaGreen或水解探针进行PCR扩增


4.读取并分析结果

将96孔板放入微滴分析仪,顺序吸取每个样品的微滴并随载液流逐一通过双色检测器;有荧光信号的微滴为阳性,无荧光信号的微滴为阴性,软件会记录每个样品里阳性微滴的比例;软件自动分析数据并以多种方式显示检测结果

读取并分析结果

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