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实验技术交流

荧光定量PCR - 实验步骤 - 实验方法

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2019/5/7     浏览次数:    

本文以细胞样品为例详细介绍了荧光定量PCR实验所需材料、试剂、仪器以及完整的实验步骤方法,供大家学习交流。

相关教程:做好荧光定量PCR实验的10个关键,你知道多少?


实验材料:细胞样品

实验试剂:RNA提取试剂盒、荧光定量PCR Mix、TRIZOL、dNTP、氯仿、逆转录酶MMLV、异丙醇、Taq酶、DEPC水、ddH2O、TE、MgCl2、琼脂糖、溴化乙锭、MOPS、甲醛、乙酸钠、EDTA、EB、溴酚兰

实验仪器:离心管、离心机、风光光度计、电泳槽、凝胶板、Realtime PCR仪

实验步骤:

1.样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每 1ml 的 TRIZOL 试剂裂解的祥品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后 ,15℃到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。 RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀:将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀

其中的RNA,混匀后15℃到30℃孵育10分钟后,千4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗:移去上清液,每1ml TRIZ OL 试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇( 75%乙醇用 DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟.

⑤RNA干燥:小心吸去大部分乙醇溶液 ,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀:溶解RNA时 ,先加入无RNA酶的水40µl用枪反复吹打几次,使其完全溶解 ,获得的 RNA 溶液保存于-80℃待用.


2.RNA质量检测

1)紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定

A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(mug/ml)计算公式为:A260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。

具体计算如下:
RNA溶于40 ul DEPC水中,取5 ul,1:100稀释至495 ul的TE中,测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
取5 ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 ul,剩余RNA总量为: 
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

②纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。


2)变性琼脂糖凝胶电泳测定 

制胶 
1g琼脂糖溶于72 ml水中,冷却至60℃,10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS电泳缓冲液 

0.4 M MOPS,pH 7.0
0.1 M
乙酸钠
0.01 M
EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 
准备RNA样品 
取3ug RNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。 
电泳 
上样前凝胶须预电泳5 min,随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。 
紫外透射光下观察并拍照 
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

3.样品cDNA合成
反应体系

序号
反应物 剂量
1 逆转录buffer 2 ul
2 上游引物 0.2 ul
3 下游引物 0.2 ul
4 dNTP 0.1 ul
5 逆转录酶MMLV 0.5 ul
6 DEPC 5 ul
7 RNA模板 2 ul
8 总体积 10 ul
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。 
混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5 ul,37℃水浴60分钟。 
取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。


4.梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR
β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3 μl按10倍稀释(加水27 ul并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。
反应体系如下:
标准品反应体系

序号
反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 阳性模板上游引物F 0.5 ul
3 阳性模板下游引物R 0.5 ul
4 dNTP 0.5 ul
5 Taq酶 1 ul
6 阳性模板DNA 5 ul
7 ddH2O 32.5 ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。 
管家基因反应体系:
序号
反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 内参照上游引物F 0.5 ul
3 内参照下游引物R 0.5 ul
4 dNTP 0.5 ul
5 Taq酶 1 ul
6 待测样品cDNA 5 ul
7 ddH2O 32.5 ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合, 6000 rpm短暂离心。
制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃ 2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。

5.制备用于绘制梯度稀释标准曲线DNA模板 
针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系
序号
反应物 剂量
1 10xPCR缓冲液 2.5 ul
2 MgCl2溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5  dNTP混合液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至总体积为 25 ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟);72延伸5分钟。
PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 
将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1x1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
 
6.待测样品的待测基因实定量PCR
所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。 
体系配置如下:

序号
反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1 ul
3 下游引物 1 ul
4 dNTP 1 ul
5 Taq聚合酶 2 ul
6 待测样品cDNA 5 ul
7 ddH2O 30 ul
8 总体积为 50 ul
轻弹管底将溶液混合,6 000 rpm短暂离心。 
将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃ 2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。


7.实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

8.电

各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

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